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成功植入胰腺干細胞的步驟

2011-04-11 [1938]

   成功植入胰腺干細胞的步驟     

1、細胞的制備;細胞的來源:采用流產人胚胎(5-7月胎齡)胰腺組織,于解剖顯微鏡下去除周圍的脂肪和結締組織。輕輕地分離并切碎胰腺,膠原酶370C震胰蕩消化30分鐘,然后加冷牛血清和Hanks液保護細胞并終止消化。此方法不但可以分離外分泌腺,還可以降低免疫原性從而減少免疫排斥反應。1500轉離心10分后棄上清,用生長液保存具有生理功能的細胞備用,達到細胞量再行植入。

   2、胰腺干細胞的制備:由于胚胎數量不足,往往不能滿足胰島細胞種植的需要,就須在體外進行擴增,達到種植的細胞量。方法同胰島細胞的制備,在細胞終止消化后靜置10分,棄上清,0。25%胰蛋白酶370C消化至細胞懸液,在無糖DMEM培養基(含非必需氨基酸,B27)中培養。兩天后換液加入終濃度為10µg/ml的KGF,1mg/ml的ITS。以后每三天換液一次并改換培養基的成分為葡萄糖濃度為17。8mmol/L,10mmol/L尼可酰氨,2%胎牛血清(誘導)其他營養成分不變,觀察其生長情況并在其6-7天時進行傳代(擴增)。

   3、細胞植入:當胰島細胞和胰腺干細胞的數量達到糖尿病人種植時,先進行細胞的生理功能鑒定及病毒和細菌培養,排除病毒和污染后再行移植。

   ㈠、細胞數量是影響種植成功的關鍵因素,因此每個人種植的數量是不同的,嚴格按每公斤體重6000個胰島當量以上進行植入。

   ㈡、細胞的純度,即將培養好的胰腺細胞采用雙硫腙染色以平板計數法結合EIN法對胰島陽性細胞計數,通常細胞純度在80%左右。

   ㈢、細胞活性鑒定:采用吖啶橙和碘丙啶對細胞進行染色,吖啶橙染色后在熒光顯微鏡下活細胞呈綠色熒光,死亡的細胞碘丙啶染色結合后發出紅色熒光。細胞染色后活度要達到90%以上。

   4、降低免疫原性:防止免疫排斥反應是植入細胞成功的關鍵之一,當細胞在制備中370C消化30分鐘,即可降低其免疫原性;應用免疫抑制劑對防止植入細胞后的急性排斥反應很重要,成人植入后,聯合應用免疫抑制劑包括環孢素A、硫唑嘌呤、霉酚酸脂、他克莫司等。約服用一個月的免疫抑制劑無免疫排斥反應即可停用。5-20歲處在生長發育期慎用或不用,或改用不影響發育的免疫排斥劑。

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