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小鼠ELISA試劑盒實驗操縱規則

2024-12-24 [686]

       小鼠ELISA試劑盒法是免疫診斷中的一項新技術,現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定,根據已經使用的結果,以為小鼠ELISA試劑盒法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操縱等特點。不僅適用于臨床標本的檢查,而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此,也適合于血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體,而且也可用于測定體液中的循環抗原,所以也是一種早期診斷的良好方法。

小鼠ELISA試劑盒

可概括四個方面: 

1、免疫酶染色各種細胞內成份的定位。 

2、研究抗酶抗體的合成。

 3、顯現微量的免疫沉淀反應。

 4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。

基本方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 

1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃過夜。越日,棄往孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。 

2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空缺孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。 

3. 加酶標抗體:于各反應孔中,加進新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小時,洗滌。 

4. 加底物液顯色:于各反應孔中加進臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘。 

5. 終止反應:于各反應孔中加進2M硫酸0.05ml。 

6. 結果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以“+"、“-"號表示。也可測O·D值:在小鼠ELISA試劑盒檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空缺對照孔調零后測各孔O·D值,若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

基本方法二 用于檢測未知抗體的間接法: 

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml, 每孔加0.1ml,4℃過夜。越日洗滌3次。 

↓ 

加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空缺、陰性及陽性孔對照) 

↓ 

于反應孔中,加進新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml,37℃孵育30-60分鐘,洗滌,后一遍用DDW洗滌。 

↓ 

其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。

(二) 酶與底物

       酶結合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯劑作用下聯結的產物。是 小鼠ELISA試劑盒成敗的關鍵試劑,它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應,還具有酶促反應,顯示出生物放大作用,但不同的酶選用不同的底物。

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